La proteasa principal del virus SARS-CoV-2 (Mpro) en test serológicos
| COVID-19
Hasta la fecha, la gran mayoría de las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos específicos contra el SARS-CoV-2 se basan en la detección en suero de anticuerpos contra la proteína Spike (el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes) o la proteína de la Nucleocápside , que se sabe que son altamente inmunogénicas en otros coronavirus. Sin embargo, otras proteínas virales no estructurales, concretamente la proteasa principal del virus (3CLpro/Mpro) han demostrado ser potentes inmunógenos.
▌ La proteína Mpro es un antígeno potente en los pacientes infectados que puede utilizarse en las pruebas serológicas.
Aunque esta proteína no está expuesta en la partícula viral, Mpro desempeña un papel crítico en la replicación viral. Al igual que otros beta-coronavirus, el SARS-CoV-2 es un virus de ARN de sentido positivo que expresa todas sus proteínas como una única cadena polipeptídica y Mpro escinde la poliproteína 1ab para dar lugar al resto de las proteínas maduras del virus. Dado que esta actividad es esencial para el ciclo de vida del virus, se ha estudiado intensamente la estructura y la función de Mpro. En particular, se ha sugerido que la Mpro es un objetivo para inhibidores específicos que podrían actuar como potentes agentes antivirales.
▌ Los anticuerpos específicos contra la Mpro pueden ser detectados en el suero de los pacientes con COVID-19 con alta especificidad y sensibilidad.
Según el estudio realizado por el CSIC en colaboración con el Immunostep, los individuos infectados por coronavirus generan una respuesta de anticuerpos contra la proteasa Cys-like (Mpro). Para este estudio, se utilizaron otras proteínas SARs-CoV-2, comúnmente utilizadas en las pruebas de serología, y se expresaron Mpro y NP en E coli y también se utilizaron dos construcciones diferentes del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína Spike.
Se reclutaron 36 pacientes de la Covid-19 con PCR positiva y 33 donantes sanos y se realizaron ensayos ELISA para detectar Mpro, así como anticuerpos específicos contra el RBD y la nucleocápside de las subclases IgG, IgA e IgM en el suero. Como resultado de esta investigación, se pudo observar que la especificidad y la sensibilidad fueron superiores al 90% para la detección de anticuerpos IgG de las tres pruebas de proteínas, con valores de sensibilidad y especificidad para Mpro del 97% y el 100% respectivamente. Otros análisis mostraron una tendencia a respuestas de anticuerpos de mayor título en los pacientes con enfermedad más grave, siendo más pronunciados para la IgM contra Mpro y RBD.
Figura 1: Infografía y mapa de calor que muestra cómo el ensayo ELISA Mpro proporciona valores sobresalientes de sensibilidad y especificidad que permiten confirmar a los pacientes con infección reciente o previa y abren nuevas preguntas inmunológicas sobre la heterogeneidad de la respuesta humoral contra las proteínas virales entre los pacientes y el uso potencial de Mpro como indicador de pronóstico.
▌ Un ensayo para detectar anticuerpos IgA contra la principal proteasa del SARS-CoV-2 «Mpro» mediante ELISA.
Existen cinco clases diferentes de anticuerpos humanos, también llamados inmunoglobulinas. De estas inmunoglobulinas, tres (IgG, IgM e IgA) se utilizan habitualmente en las pruebas serológicas para el diagnóstico de diferentes enfermedades. La IgA está presente en altas concentraciones en las membranas mucosas, particularmente en las paredes internas del tracto respiratorio y gastrointestinal, así como en la saliva y las lágrimas, y es de hecho la inmunoglobulina más importante para combatir los patógenos infecciosos en el sistema respiratorio y digestivo en el punto de entrada del patógeno. Se ha descrito ampliamente la detección de IgA específica en el suero de pacientes infectados por el SARS-CoV-2, siendo su aparición más temprana, fuerte y persistente que la IgM. En general, se ha comunicado que el tiempo medio de seroconversión de IgA, IgM e IgG es de 4-6, 4-6 y 5-10 días después del inicio de los síntomas, respectivamente6. Estos datos sugieren que la detección de IgA puede mejorar el resultado del diagnóstico en las fases tempranas de la infección y los convierte en buenos marcadores potenciales para identificar a los pacientes con COVID-19.
Como hemos descrito anteriormente, la gran mayoría de las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos específicos contra el SARS-CoV-2 se basan en la detección en suero de anticuerpos contra la proteína S (principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes) o contra la proteína N, que se sabe que es una proteína altamente inmunogénica en otros coronavirus y es la más utilizada. En este sentido, en búsqueda de aumentar las posibilidades de diagnóstico de los pacientes de COVID-19, en Immunostep hemos desarrollado este ensayo que se basa en la detección de anticuerpos específicos contra esta principal proteasa viral (Mpro o 3CLpro), que juega un papel crítico en la replicación viral. (Ensayo ELISA Anti-SARS-CoV-2 Immunostep Mpro)
El kit contiene placas tapizadas con la proteína recombinante Mpro. En un primer paso, la muestra diluida del paciente se incuba en los pocillos, permitiendo que los anticuerpos específicos del antígeno se unan a la proteína Mpro. Después de lavar los pocillos, para eliminar los anticuerpos no unidos, en un segundo paso de incubación, se añade un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana (IgA/IgG) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de un segundo paso de lavado, se añade el sustrato tetrametilbencidina (TMB) que hace que la enzima conjugada con el anticuerpo anti-IgA o anti-IgG catalice una reacción de color. La intensidad del color de la reacción es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos del antígeno presentes en la muestra.
Figura 2: Representación gráfica del principio y el método de los ensayos ELISA.
▌ Mpro se puede detectar para diferenciar los perfiles de respuesta inmunitaria.
Otro estudio realizado por el CSIC en colaboración con Immunostep demostró que el uso de los antígenos anteriormente mencionados (RBD, proteína S y N) en combinación con el inmunógeno Mpro puede describir de forma más completa la magnitud y la duración de la respuesta inmunitaria en pacientes infectados por el SARS-CoV-2. Para facilitar la caracterización exhaustiva de los pacientes con COVID-19 con alto rendimiento, se desarrolló un ensayo multiantígeno con varios antígenos virales inmovilizados en microesferas fluorescentes, para permitir la detección por citometría de flujo de los múltiples anticuerpos generados durante las infecciones por SARS-CoV-2.
A medida que la pandemia ha ido avanzando, se ha establecido que no todos los pacientes responden de la misma manera a la infección por SARS-CoV-2. De hecho, se ha descrito un amplio conjunto de manifestaciones clínicas y se ha sugerido que diferentes tipos de respuesta inmunitaria pueden contribuir a estas diferentes presentaciones. Por lo tanto, probablemente será relevante caracterizar las respuestas de anticuerpos potencialmente sesgadas cuando se explore la asociación entre la infección por el CoV 2 del SRAS y las diferentes manifestaciones clínicas.
Como resultado de esta investigación, pudimos observar diferencias en las respuestas de Ig específicas contra los cuatro antígenos, lo que permite discriminar fácilmente entre los individuos vacunados y los infectados de forma natural (Ensayo Multiplex Anti-SARS-CoV-2). Además, el análisis permitió clasificar a los pacientes y a los controles sanos, sin ningún error, sólo con los datos de IgG.
Así, una simple prueba serológica multiantígeno discrimina claramente entre pacientes y controles sanos con una confianza del 100%. La modificación del algoritmo para tener en cuenta los datos del isotipo de Ig también permitió una discriminación de alta confianza entre las presentaciones leves y graves de la enfermedad COVID-19, al menos de forma retrospectiva.
Figura 3: Comparativa de datos de muestras de vacunados analizados con ensayo multiplex de SARS-CoV-2 con muestras positivas y negativas.
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