Aplicaciones de la citometría de flujo en serología de la Covid-19

La citometría de flujo es una potente técnica de análisis celular multiparamétrico que, mediante anticuerpos marcados con fluorocromos, permite medir simultáneamente múltiples características físicas de una población celular.

Se basa en hacer pasar una suspensión de células alineadas delante de un rayo láser. Este láser excitará los fluorocromos de los anticuerpos unidos a las células, provocando una emisión de intensidad proporcional a su concentración, que será captada por diferentes detectores a distintas longitudes de onda de emisión. En este sentido, la citometría de flujo es una técnica muy versátil.

▌¿Por qué utilizamos la citometría de flujo en inmunología? 

La citometría de flujo es un potente método utilizado para medir el número de células, la viabilidad celular, la muerte celular programada (apoptosis), la división celular, la toxicidad y la expresión diferencial de proteínas específicas que pueden ayudar a los científicos a comprender la biología del desarrollo embrionario, el cáncer, el metabolismo y la degeneración, las enfermedades, los efectos de los medicamentos e incluso el envejecimiento.

En este sentido, Immunostep, proveedor líder de tecnologías, herramientas y servicios para la investigación en biociencia y la fabricación de productos biofarmacéuticos, ofrece una variedad de ensayos, kits y soluciones para la citometría de flujo.

Con la citometría de flujo es posible etiquetar una o muchas características moleculares de las poblaciones celulares de una muestra de sangre o de médula ósea (incluso de tejidos disociados), lo que permite un estudio más completo, complejo, representativo y potente que complementa el análisis morfológico microscópico.

La citometría de flujo multiparamétrica está adquiriendo en los últimos años un papel importante en el área de la hematología y la inmunología, debido a las características particulares de la técnica que permiten una mejora sustancial en el conocimiento de la hematopoyesis normal y, como consecuencia, una mejor comprensión de la fisiopatología de las enfermedades onomatológicas y del sistema inmunitario.

▌ ¿Cómo funciona la citometría de flujo aplicado a las pruebas serológicas de la Covid-19?

Como ya hemos explicado en artículos anteriores, el genoma del SARS-CoV-2 codifica 4 proteínas estructurales: la proteína E (envoltura), la proteína M (membrana), la proteína N (nucleocápside) y la proteína S (proteína de la espiga), donde también encontramos el dominio RBD; y el genoma del SARS-CoV-2 también expresa 27 proteínas no estructurales (que se liberan tras la infección celular).

Las pruebas serológicas disponibles hasta ahora pueden dirigirse a las diferentes inmunoglobulinas (isotipos) pero las detectan individualmente, sin embargo un ensayo de citometría de flujo es capaz de detectar estos tres isotipos simultáneamente.

¿Por qué es esto interesante? Cada uno de esos anticuerpos nos da una información diferente ya que son producidos por el sistema inmunitario en diferentes momentos dentro del periodo de infección.

►La inmunoglobulina A (IgA) es la primera en aparecer, ya que se localiza en superficies mucosas como las vías respiratorias, que es la principal vía de entrada del virus, aunque también se detecta en el suero del paciente.

►La IgM (inmunoglobulina M) también aparece en las primeras fases de la infección e indica que el individuo está en la respuesta inicial a la infección.

►La IgG (inmunoglobulina G) se produce en una fase más avanzada de la infección y puede persistir en el tiempo, lo que indica que un individuo ha sufrido la enfermedad en el pasado.

Nuestras investigaciones en este campo han demostrado que, en el caso concreto del virus SARS-CoV-2, la inmunoglobulina A se sintetiza antes que la IgM.

De hecho, en todas nuestras pruebas serológicas (ya que también hemos desarrollado pruebas ELISA) hemos podido detectar IgA antes que IgM. Además, hemos podido detectar en algunos pacientes las inmunoglobulinas IgA incluso antes de la aparición de los síntomas y, en este sentido, hemos observado que los valores de especificidad para la IgA son mayores que para la IgM, razón por la cual nuestros kits serológicos están desarrollados contra la IgG y la IgA.

▌ ¿Cuál es la diferencia entre este ensayo serológico y los ensayos ELISA?

A medida que la pandemia avanza, se descubren nuevas manifestaciones del virus, y es necesario evaluar de forma más profunda, cualitativa y cuantitativa la respuesta inmunitaria al virus, lo que implica el estudio de los diferentes anticuerpos en respuesta a diferentes proteínas, el número de anticuerpos y su duración para diferentes perfiles de individuos.

Si utilizamos los actuales ensayos serológicos disponibles (ELISAS, o CLIAS) para obtener toda esta información sobre las inmunoglobulinas y proteínas implicadas, necesitaríamos gastar muchos reactivos y tiempo para evaluar un gran número de resultados.

En este sentido, buscando una alternativa a esos ensayos, desarrollamos este ensayo de citometría de flujo multiplex, que es altamente específico y sensible midiendo la presencia o ausencia de 3 tipos de inmunoglobulinas contra 4 proteínas virales diferentes del SARS-CoV-2, simultáneamente. Estos 4 antígenos son:

► Dominio de unión al receptor (RBD) de la glicoproteína S. Este dominio RBD es un trímero estabilizado que permite la detección precisa de anticuerpos neutralizantes del subtipo IgG.

► Proteína SPIKE. una glicoproteína trimérica (Spike) que es la forma nativa estabilizada de la proteína Spike del SARS-CoV-2. Desde el punto de vista del diagnóstico, el uso de estructuras triméricas para SPIKE y RBD nos permitirá detectar una gama más amplia de anticuerpos neutralizantes, mejorando la sensibilidad y la precisión del seguimiento del progreso de la respuesta del sistema inmunitario.

► Proteína de la nucleocápside (N). Esta proteína es altamente inmunogénica y es la más abundante del virus. Tiene una gran afinidad por el ARN viral con el que interactúa.

► La principal proteasa del virus (3CLpro, Mpro) que sólo se expresa si el virus entra en nuestras células, y es tan inmunogénica como la nucleocápside. Investigadores españoles demostraron su enorme potencial en las pruebas de serología.

La razón principal por la que nos pareció útil analizar 4 antígenos simultáneamente es la heterogeneidad de la respuesta inmunitaria, que varía de un individuo a otro. Cuanta más información obtengamos en el análisis de cada paciente, mejor diagnóstico podremos ofrecer. Además, al dirigirse a 4 antígenos, es más difícil no detectar falsos negativos de una posible persona infectada o vacunada.

▌ ¿Cómo se obtiene toda esta información gracias a la técnica de citometría de flujo? 

► En primer lugar, tendremos microesferas tapizadas con las diferentes proteínas. Estas microesferas son microesferas magnéticas de 6 micras de tamaño, autofluorescentes para el canal FL3 y FL4 y están teñidas internamente con intensidades variables de fluorescencia. Cada microesfera estará recubierta con un antígeno específico descrito anteriormente.

► Cuando añadimos la muestra, los anticuerpos presentes en esa muestra se unen a la microesfera magnética. Estos anticuerpos están conjugados con tres fluorocromos diferentes: FITC, PE y PE-cianina7 respectivamente.

► Así, al añadir la solución al citómetro de flujo, estos fluorocromos emitirán una señal del color correspondiente que indicará la presencia de anticuerpos de cada tipo para cada proteína que se haya unido a la microesfera.

Además, estas microesferas se suministran en una concentración de 1.000 microesferas por prueba. Cada una de estas microesferas correspondería a una prueba realizada en un pozo de ELISA.

Esto significa que para cada prueba que realizamos, es como si estuviéramos realizando 1000 ELISAs simultáneamente. El resultado obtenido en cada prueba es la media de estos 1000 ELISAs, lo que lo convierte en un ensayo muy potente, fiable y reproducible.

▌ ¿Cómo se realiza este ensayo serológico para la Covid-19?

El método es fácil. El procedimiento tiene 8 pasos, y se realiza en una hora y media. Después de ese tiempo, tendremos las muestras listas para ser analizadas en el citómetro. El ensayo se puede realizar en cualquier citómetro estándar convencional (es de formato abierto) y no se necesita un software específico para analizar los resultados.

Así, el uso de microesferas magnéticas nos permitirá decantar más de un tubo simultáneamente, lo que hace que el protocolo sea más rápido de realizar.

Un aspecto importante a tener en cuenta es cómo recoger la muestra, plasma o suero. Las muestras deben ser inactivadas adecuadamente. Para esta inactivación, puede colocar la muestra en un baño de calor durante al menos 30 minutos a 56ºC.

La cantidad de muestra a utilizar es realmente pequeña, ya que este ensayo puede realizarse con sólo 5ul de muestra.

▌ ¿Qué información puede mostrarnos una prueba serológica por citometría de flujo?

Estas pruebas tienen posibilidades infinitas, y pueden analizar una cantidad de información enorme, ya hablamos en anteriores artículos sobre algunas de estas aplicaciones en investigación.

Por dar algún ejemplo, para llevar a cabo la sensibilidad del ensayo, se analizaron muestras positivas y negativas (prepandémicas) en el citómetro de flujo. En este análisis pudimos observar una gran diferencia de canal de fluorescencia entre las muestras positivas y negativas con respecto a los controles positivos y negativos analizados.

Esta diferencia de canales se puede ver claramente para las 3 Ig por lo que podemos confirmar que nuestro kit detecta los casos positivos.

Por otro lado, para la evaluación de la sensibilidad diagnóstica, se realizó un estudio en 2 laboratorios clínicos diferentes de España, donde se analizaron las muestras y se agruparon en función de la información disponible para cada muestra, en relación con los días transcurridos desde la confirmación por PCR y el inicio de los síntomas.

El patrón obtenido para las 3 Ig permite una clara diferenciación entre muestras positivas y negativas.

En esta prueba de sensibilidad, también se compararon 35 muestras sintomáticas con muestras negativas y/o prepandémicas sin síntomas relacionados con el SARS-CoV-2. Se realizaron muchas otras preguntas y estudios para evaluar la calidad de la prueba.

Si está interesado en conocer más sobre los estudios realizados con este ensayo puede volver a ver online  el seminario completo que impartimos sobre serología y citometría de flujo, donde explicamos estos estudios y mucho más, o también puede ponerse en contacto con nosotros para obtener más información.